Recombinant production of a glycosidase by using an in-vivo cloning system and its immobilization via different strategies
[ X ]
Tarih
2020
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
İnsan sütü su hariç %54 laktoz, %32 yağ, %8 serbest oligosakkaritler (serbest glikanlar) ve %6 protein içermektedir. Serbest glikanlar insan sütünde yüksek miktarda bulunmasına rağmen, bu glikanların bebekler tarafından sindirilmesi mümkün değildir. Bir araştırmada, bu bileşiklerin aslında faydalı bakterilerin gelişiminde ve dolayısıyla bebeklerin bağışıklık sistemini güçlendirmede kullanıldığı gösterilmiştir (Lo Cascio ve diğerleri, 2007). Serbest glikanların çok değerli bir prebiyotik kaynağı olduğunun anlaşılmasından sonra, bu bileşiklere olan ilgi hızla artmıştır ve önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Anne sütünün endüstriyel anlamda üretilme olanağının çok sınırlı olması ve serbest glikanların diğer sütlerdeki oranının (inek sütü % 0.1) oldukça düşük olması nedeniyle, anne sütüne erişim olanağı olmayan bebeklere, serbest glikanların temini konusunda çok ciddi bir açık bulunmaktadır. Bu eksikliği gidermek amacı ile araştırmacılar kimyasal yapıca glikan özelliği gösterebilecek başka bileşiklerin keşfine yönelmiştir ve serbest glikanlara oldukça benzer başka bileşiklerin proteinlere N- ve O-glikosidik bağlarla bağlı şekilde (glikoproteinler) bulunduğunu göstermişlerdir. Glikanlar, prebiyotik etkileri yanında, hücreler arası etkileşimde, proteinlerin düzgün bir şekilde katlanmasında ve stabilizasyonunda da önemlidir. Fakat glikanların bu biyolojik ve fiziko-kimyasal özellikleri, glikoproteinlerden ayrılmaları için kullanılan yöntemlerin yetersizliği yüzünden tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüzde kullanılan kimyasal ve enzimatik yöntemler, bütün glikanları glikoproteinlerden ayıramamakta ya da bu yöntemler güçlü kimyasal ve ısı kullanımı gerektirdiğinden, glikanların ve geride kalan protein kısmının yapısını bozmaktadır. Bu eksikliği gidermek için yeni bir enzim olan endo-?-N- asetilglukozaminidaz, Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697'dan ilk 2015 yılında izole edilmistir (Karav ve diğerleri, 2015a). Bu enzim herhangi bir ısıl işleme ve kimyasal kullanımına gereksinim duymadan, glikanların biyolojik etkinliği kaybolmadan izole edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu yüzden günümüzde glikanların yüksek ölçüde izole edilip biyolojik görevlerinin araştırılmasına olanak sağlayan tek strateji olarak bu enzimin kullanımı kabul edilmektedir. Bu tez çalışmasında ilk olarak, ticari olarak temini mümkün olmayan endo-?-N-asetilglukozaminidaz enziminin rekombinant olarak üretilmesi hedeflenmiştir. Bu enzimi kodlayan genin moleküler klonlaması için yeni bir teknik olan in-vivo klonlama tekniği kullanılmıştır ve farklı immobilizasyon stratejileri (adsorpsiyon, hapsedilme ve kovalent bağlama) denenerek enzimin geri kazanımının sağlanması hedeflenmiştir. Elde edilen immobilize enzimlerin aktiviteleri model terapötik proteinler üzerinde denenmiş ve serbest enzimden sonra en yüksek aktivite gösteren enzim formunun adsorbsiyon stratejisi ile immobilize edilen enzim olduğu görülmüştür. Daha sonra elde edilen glikanlar ileri kütle spektrometresi kullanılarak karakterize edilmiştir. Uzun süreli inkübasyon sonucunda, farklı stratejiler ile immobilize edilen enzimlerin bütün N-bağlı glikanları kesebildiği gösterilmiştir.
Human milk, except water, contains 54% lactose, 32% lipids, 8% free oligosaccharides (free glycans) and 6% protein. Although, the concentration of free oligosaccharides in human milk is very high, they are not digestible by infants. A study have demonstrated that these compounds stimulate the growth of beneficial bacteria, so they are used to promote the immune system of infants (Lo Cascio et al., 2007). After this critical role of free oligosaccharides has been discovered, the interest on these compounds has greatly increased. Because human milk can not be produced at industrial scale and the concentration of free glycans in other mammalian milks is too low (bovine milk 0.1%), the delivery of these compounds to the infants, which they have not access to breast milk is very limited. To solve this problem, scientists have found that other compounds that are structurally similar to free glycans are attached to proteins via N- or O- glycosidicially (glycoproteins). Glycans are important for cell-to-cell interactions, proper protein folding and stabilization as well as their prebiotic activity. However, the mechanism of these biological roles has not been elucidated well due the lack of isolation of glycans from glycoproteins. The current chemically and enzymatically isolation methods used for deglycosylation are not able to cleave all glycans and they require high heat and detergent use that might denature the structure of glycan and remaining polypeptide. To overcome this deficiency, a new enzyme, endo-?-N-acetylglucosaminidase was first isolated from Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 in the 2015 (Karav et al., 2015a). This enzyme does not require any heat denaturation of the substrate or detergent use for its activity that enables to produce the glycans without affecting their biological roles. Therefore, this enzyme might be the only strategy to isolate these glycans in large scale and investigate their biological functions. In this thesis, firstly, endo-?-N-acetlyglucosaminidase which is not commercially available was produced recombinantly. A novel technique for molecular cloning of this enzyme encoding gene was used in-vivo cloning technique and the enzyme was immobilized by various strategies (adsorption, entrapment and covalent binding) to achieve the re-use of the enzyme. The activities of the resulting immobilized enzymes were tested on model therapeutic proteins and it was seen that the immobilized enzyme form by the adsorbtion strategy has the highest activity after the free enzyme form. Then resulting glycans were characterized using advanced mass spectrometry. As a result of long-term incubation, it has been shown that enzymes immobilized with different strategies can cleave all N-glycan structures.
Human milk, except water, contains 54% lactose, 32% lipids, 8% free oligosaccharides (free glycans) and 6% protein. Although, the concentration of free oligosaccharides in human milk is very high, they are not digestible by infants. A study have demonstrated that these compounds stimulate the growth of beneficial bacteria, so they are used to promote the immune system of infants (Lo Cascio et al., 2007). After this critical role of free oligosaccharides has been discovered, the interest on these compounds has greatly increased. Because human milk can not be produced at industrial scale and the concentration of free glycans in other mammalian milks is too low (bovine milk 0.1%), the delivery of these compounds to the infants, which they have not access to breast milk is very limited. To solve this problem, scientists have found that other compounds that are structurally similar to free glycans are attached to proteins via N- or O- glycosidicially (glycoproteins). Glycans are important for cell-to-cell interactions, proper protein folding and stabilization as well as their prebiotic activity. However, the mechanism of these biological roles has not been elucidated well due the lack of isolation of glycans from glycoproteins. The current chemically and enzymatically isolation methods used for deglycosylation are not able to cleave all glycans and they require high heat and detergent use that might denature the structure of glycan and remaining polypeptide. To overcome this deficiency, a new enzyme, endo-?-N-acetylglucosaminidase was first isolated from Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 in the 2015 (Karav et al., 2015a). This enzyme does not require any heat denaturation of the substrate or detergent use for its activity that enables to produce the glycans without affecting their biological roles. Therefore, this enzyme might be the only strategy to isolate these glycans in large scale and investigate their biological functions. In this thesis, firstly, endo-?-N-acetlyglucosaminidase which is not commercially available was produced recombinantly. A novel technique for molecular cloning of this enzyme encoding gene was used in-vivo cloning technique and the enzyme was immobilized by various strategies (adsorption, entrapment and covalent binding) to achieve the re-use of the enzyme. The activities of the resulting immobilized enzymes were tested on model therapeutic proteins and it was seen that the immobilized enzyme form by the adsorbtion strategy has the highest activity after the free enzyme form. Then resulting glycans were characterized using advanced mass spectrometry. As a result of long-term incubation, it has been shown that enzymes immobilized with different strategies can cleave all N-glycan structures.
Açıklama
Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomoleküler Bilimler Ana Bilim Dalı
Anahtar Kelimeler
Biyokimya, Biochemistry, Biyoteknoloji
