A novel in-vitro digestion model designed by integration of microbiome associated enzymes

Abstract

İnsan mikrobiyotası, milyonlarca sayıda mikroorganizma içermektedir ve bu mikroorganizmalar beyin bağırsak etkileşimi ve enerji metabolizması gibi birçok önemli biyolojik fonksiyonda görev almaktadır. Özellikle, birçok komensal bakteri sahip oldukları özel enzim sistemi ile sindirim işleminde önemli roller oynamaktadır. Glikan diye isimlendirilen prebiyotik bileşenler, insan enzimleri tarafından sindirilemediklerinden bağırsağa kadar denatürasyona uğramadan ulaşmaktadırlar. Bağırsakta ise bazı bakteriler sahip oldukları enzimler (glikozidazlar vb.) sayesinde glikanları karbon kaynağı olarak kullanabilmektedir. Glikanlar gibi prebiyotiklerin sindirilme mekanizmasını daha iyi anlamak için in-vitro sindirim modelleri kullanılmaktadır. Fakat, kullanılan in-vitro sindirim modellerinde sadece insan kaynaklı enzimlerin yer alması bu modellerin mikroorganizmaların sindirimdeki etkisini inceleyen çalışmalarda kullanılmasını engellemektedir. Bu yüzden, mikrobiyal enzimlerin yer aldığı yeni sindirim modellerinin tasarımı glikan çalışmaları için kritik öneme sahiptir. Bu tez kapsamında, öncelikle insan sindirim sisteminin farklı bölgelerinde baskın olarak bulunan mikroorganizmalar ve bu mikroorganizmalara ait glikozidaz enzimleri biyoinformatik yöntemler kullanılarak belirlenmiştir. Belirlenen ve seçilen 32 glikozidaz rekombinant olarak uygun bir moleküler klonlama sistemi ile klonlanmış ve üretilmiştir. Üretilen rekombinant enzimler, sadece insan kökenli sindirim enzimlerini içeren standart bir in-vitro sindirim modeline entegre edilmiştir ve bir glikoprotein kaynağı olan whey üzerinde test edilmiştir.

The human microbiota consists of much more microbial cells than human cells and they are associated with a myriad of biological functions ranging from gut-brain signaling to energy metabolism. Importantly, most gut commensals are involved in the human digestion process using their carbohydrate-active enzymes (CAZymes) like glycosidases, which are used to cleave polysaccharide chains, also called glycans, into monomers to benefit both themselves and the host. Glycans cannot be digested by human-derived enzymes due to the lack of specific enzymes. Therefore, glycans reach the colon where some bacteria can metabolize them by their unique enzymes. To better understand glycan digestion by microbial metabolism, in-vitro digestion models could be a great way to study the interaction between microbial enzymes and glycans in laboratory conditions. However, current in-vitro digestion models are not available for glycan studies due to the lacking the human enzyme specificity. Thus, the design of novel models including host and microbiome-associated enzymes is critical to paving the way for glycan research. Within the purpose of this thesis, novel glycosidases were examined from different microorganisms, which predominate in the human digestive system, using bioinformatic tools. Then, 32 unique enzymes were recombinantly cloned with a cloning and expression system and produced. The selected enzymes were integrated into a conventional in-vitro digestion model which includes only human-associated digestion enzymes. Finally, the new digestion model designed by recombinant microbial enzymes integration was tested on a glycoprotein source, whey.