Turunçgil klorotik cüceleşme ile ilişkili virüs (Citrus chlorotic Dwarf associated virus; CCDaV)'ün etiolojisi ve moleküler karakterizasyonu

Abstract

Citrus chlorotic dwarf associated virus (CCDaV) ülkemizde 1980'li yılların sonlarında ortaya çıkmıştır. Virüsün ülkemizdeki varlığı sadece Doğu Akdeniz Bölgesi'nde (DAB) bildirilmiş, diğer önemli turunçgil üretim bölgelerindeki varlığına yönelik herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Bu amaçla etmenin diğer üretim bölgelerinde varlığını belirlemek için bir sörvey çalışması ve aynı zamanda CCDaV'nin populasyon yapılarının moleküler özelliklerinin belirlenmesi için DAB'ta bir arazi çalışması yürütülmüştür. Sörvey çalışması kapsamında turunçgil üretim bölgelerinde ticari, rekreasyon, ev, otel vb. gibi bahçelere tesadüfi arazi çıkışları düzenlenmiş, bitkiler görsel olarak incelenmiş, CCDaV benzeri belirti gösteren bitkilerden toplam 143 örnek toplanmıştır. DAB üretim alanlarında ise daha önceden CCDaV ile enfekteli olduğu bilinen ve tesadüfi olarak girilen bahçelerden toplam 42 örnek toplanmıştır. Toplanan tüm örnekler PCR ile testlenmiştir. PCR çalışmaları sonucu 143 örnekten 2'si, DAB'ta ise 42 örnekten 41'i CCDaV ile enfekteli olarak bulunmuştur. Yapılan çalışmalar sonucunda Antalya ilinde bir otel bahçesinde ve İzmir ilinde bir fidanlıkta ilk kez DAB dışında CCDaV enfeksiyonu tespit edilmiştir. Ancak ticari olarak turunçgil yetiştiriciliği yapılan alanlarda ise CCDaV enfeksiyonu tespit edilmemiştir. PCR ile enfekteli bulunan CCDaV izolatları arasından toplandığı bölgeler ve çeşitler göz önünde bulundurularak seçilen toplam 6 izolatın tüm genom bölgesinin, 25 izolatın ise CP (Coat protein) geni bölgesinin moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. CCDaV izolatlarının tüm genom ve sahip olduğu gen bölgelerine göre birbirleri ve dünya izolatları ile nükleotit (nt) ve amioasit (aa) düzeyinde %96-100 oranında benzerlikler gösterdiği belirlenmiştir. Filogenetik analizlerde Türk ve Çin izolatlarının coğrafik orijine göre birbirlerinden ayrıldığı görülmüştür. CCDaV izolatların CP genine göre kendi içlerinde ve dünya izolatları ile hem nt hem de aa düzeyinde gerçekleştirilen çoklu dizi analizleri sonucunda birbirleri ve dünya izolatları ile genel olarak %98'in üzerinde benzerlikler gösterdiği belirlenmiştir. Filogenetik analizler sonucunda ise CCDaV izolatlarının elde edildikleri konukçu türlerine göre bir ilişki göstermediği fakat coğrafik orijin olarak Türk ve Çin izolatlarının birbirinden ayrıldığı görülmüştür. Ayrıca gerçekleştirilen bu çalışma kapsamında CCDaV'nin farklı bitki dokularındaki (yaprak, çiçek, meyve) varlığı ve mevsimsel olarak konsantrasyonun belirlenmesi amaçlanmıştır. Dört mevsim boyunca CCDaV ile enfekteli olduğu tespit edilen bir limon ağacından mevsim ortalarında farklı doku ve farklı yönlerden örnekler alınarak etmenin varlığı ve konsantrasyonu real-time PCR (qPCR) ile araştırılmıştır. Gerçekleştirilen qPCR çalışmaları sonucunda; CCDaV'nin varlığı yaprak, çiçek ve meyvede tespit edilmiştir. Ayrıca, CCDaV'nin farklı mevsim ve yönlerdeki konsantrasyon değişimleri arasında ilkbahar aylarında batı yönünden gerçekleştirilen örneklemelerdeki konsantrasyon seviyesinin en yüksek düzeyde olduğu görülmüştür. Bununla birlikte rutin CCDaV sörveyinin yılın herhangi bir zamanında yaprak örneklerinden yapılabileceği belirlenmiştir.

Citrus chlorotic dwarf-associated virus (CCDaV) first appeared in Turkey in the late 1980s. This virus was only reported in the Eastern Mediterranean Region (EMR) and no previous study has been conducted on its presence in the other important citrus cultivation regions of Turkey. Towards this end, surveys were randomly performed in commercial orchards, home and hotel gardens, and recreational areas in other citrus cultivation regions. The plants were examined visually and samples were collected from the plants showing symptoms similar to CCDaV. Moreover, field studies were carried out gardens randomly entered and known infected with CCDaV in the production area of EMR to determine molecular properties of CCDaV population. One hundred forty-three and 42 samples were collected from plants in other citrus cultivation regions and EMR, respectively. All samples were tested with PCR. As a result of the tests, 2 out of 143 from other citrus cultivation regions and 41 out of 42 from EMR were found to be infected with CCDaV. After molecular identification, CCDaV was detected a garden of hotel and a nursery in Antalya and İzmir provinces, respectively. To the best of our knowledge, this is the first report of CCDaV infection outside of the EMR in Turkey. However, CCDaV infection was not detected in any of the surveyed commercial citrus orchards. Molecular characterization of CCDaV isolates which were chosen based on geographic origin and host citrus species was performed based on complete genomes of six isolates and CP (coat protein) genes of 25 isolates. It was determined that CCDaV isolates showed identities 96-100% in nucleotide (nt) and amino acid (aa) levels based on complete genome and genes region level with each other and world isolates. Furthermore, it was seen that Turkish and world isolates tended to separate from each other based on geographic origin. In addition, it was determined that CCDaV isolates showed identities over 98% in nucleotide and amino acid level based on CP gene with each other and world isolates. As a result of the phylogenetic analyses, no phylogenetically specific clusters were determined in the Turkish CCDaV isolates similar to the host citrus species. However, it was seen that Turkish and Chinese isolates had a tendency to split apart from each other based on geographic origin. Moreover, it was aimed to determine the titer level of CCDaV in different tissues and seasons. CCDaV presence and titer changes were investigated by real-time PCR, while taking samples from different tissues and parts of a lemon tree infected with CCDaV in the middle of the all season. As a result of real-time PCR tests performed; the presence of CCDaV was detected in leaves, flowers and fruit. Furthermore, the concentration levels of CCDaV in different seasons and directions were found to be at the highest level in the samples taken from the west in spring months. With this result, it was determined that routine CCDaV virus infection surveys can be carried out by leaf samples at any time of the year.